Qiagen 150343 REPLI-g Single Cell Kit

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Qiagen 150343 REPLI-g Single Cell Kit 单细胞全基因组扩增试剂盒采用MDA技术，可均一的扩增单个细胞（1至1000个细菌或肿瘤细胞）或纯化的基因组DNA，能够覆盖基因组所有位点。扩增产物性质稳定，可达40 µg（产物平均长度大于>10 kb）。适用于二代测序等新技术应用。可用于癌症、干细胞或宏观基因组学（metagenomics）研究。

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Qiagen 150343 REPLI-g Single Cell Kit 单细胞全基因组扩增试剂盒产品欢迎您致电 华雅再生医学旗舰公司：红荣微再（上海）生物工程技术有限公司 

产品原理

REPLI-g Single Cell Kit 单细胞全基因组扩增试剂盒采用多重置换扩增（MDA，Multiple Displacement Amplification）技术，对所有基因组位点进行无偏差的扩增。与基于PCR的全基因组扩增技术相比，该技术具有更好的扩增保真度，避免出现假阳性或假阴性信号。

储存条件：-20°C

质控

REPLI-g Single Cell Kit 单细胞全基因组扩增试剂盒所有缓冲液和试剂生产都经过严格控制的流程，避免污染DNA，确保每次实验获得可靠的结果。

安全信息

使用REPLI-g Single Cell Kit 单细胞全基因组扩增试剂盒时，穿戴合适的实验防护·服，一次性手套和保护手套。详细信息，参见SDS。

适用样本

REPLI-g Single Cell Kit 单细胞全基因组扩增试剂盒可使用各种临床和非临床研究样品，包括已纯化的基因组 DNA（gDNA）、新鲜或干燥的血液，以及新鲜或冷冻的组织。REPLI-g Single Cell 扩增后DNA 产物平均长度 >10 kb，且完整覆盖基因组，高度适合也已经开发用于新一代测序（NGS）、芯片法比较基因组杂交（array CGH）或 qPCR 分析。

应用

REPLI-g Single Cell Kit 单细胞全基因组扩增试剂盒适用于分子生物学应用。该产品不适用于疾病的诊断、预防或治疗。推荐依据NIH发布的重组DNA实验指南或其他指南使用所有Qiagen产品。

更详细应用领域：

人 / 动物：生物标志物研究（SNP、突变、CNV），干细胞研究，循环胎儿细胞的分析（产前检测筛查），嵌合研究，遗传易感性研究，转基因动物的分型。

癌症：体细胞遗传变异分析，肿瘤发展，肿瘤干细胞 / 进化，循环肿瘤细胞（CTCs）的分析

细菌：宏基因组学 (Metagenomics)，研究病原体分析，微生物基因分型。

植物 * ：气孔研究，花粉分析。

* 无细胞壁的细胞或已纯化的基因组 DNA。

下游应用及仪器

全基因组测序、外显子组测序：新一代测序平台 †（Illumina等）

SNP 基因分型芯片、Array CGH：芯片平台 †

qPCR/PCR技术：实时定量 PCR/PCR 循环仪 †

Sanger 测序：毛细管测序仪 †

焦磷酸测序：PyroMark®（QIAGEN）

† 多个供应商

例：全基因组测序流程

细胞样本/基因组DNA——样本处理——REPLI-g Single Cell Kit扩增——新一代测序

组份规格

需要用户自备材料

微离心管

水浴或其他加热仪器

微型离心机

漩涡混合仪（Vortexer）

吸管和吸头

冰

操作方法选择

REPLI-g Single Cell Kit 单细胞全基因组扩增试剂盒需要根据起始样本选择对应操作方法

其他起始样本：血浆血清、活检、需要高通量扩增的样本等参见其他对应说明书。

操作流程

方法*程

细胞样本——加入变性混合液——65°C孵育10min——加入终止液——加入Master混合液——30°C孵育8h，65°C 终止3min——获得扩增DNA

方法二流程

纯化基因组DNA——加入变性混合液——15-25°C孵育3min——加入neutralization混合液——加入Master混合液——30°C孵育8h，65°C 终止3min——获得扩增DNA

方法一：从单细胞扩增基因组DNA

实验开始前注意事项

1.适用样本：1-1000个完整细胞

这个方法适用于所有物种的单细胞样本，如：脊椎动物，细菌（革兰氏阳性菌和阴性菌），植物（细胞壁已脱），分选细胞，组织培养细胞和细胞。

不适用样本：福尔马林固定样本或其他使用交联剂固定的样本，如：从福尔马林固定石蜡包埋组织中激光显微切割得到的单细胞样本。

2.小心试剂不要被外源DNA污染。如：使用干净独立吸头吸管，在无外源DNA地方进行反应操作。

3.纯化基因组DNA扩增参见方法二。

4.聚合酶要在冰上解冻（见步骤6）。其他成分可以室温解冻（15–25°C）。

5.配制的D2缓冲液（变性缓冲液）存放不要超过3个月。

6.阴性对照（无模板）的DNA产量约 40 µg。因为REPLI-g 的单细胞扩增反应中，引物二聚体的随机扩增得到高分子量的DNA产物。这一DNA不会影响实际样本质量，也不会影响下游分析造成阳性结果。

开始前准备

试剂预处理

1.DLB缓冲液加500µl试剂盒的水混匀，稍微离心溶解。

注意：重组的DLB缓冲液–20°C能放6个月。

Buffer DLB is pH-labile.

2.所有缓冲液和试剂使用前都要用漩涡混合器充分混匀。

仪器预设

3.水浴，heating block或热循环仪温度设为30°C。

如果热循环仪带加热盖，盖子温度设为70°C。

步骤

一 变性

1.按表1配制足量（整个扩增流程所需）D2缓冲液（变性缓冲液）。

注意：表中提供的D2缓冲液用量足够进行12次反应。没用完的D2缓冲液–20°C 存放，但不要存放超过3个月。

表1.D2缓冲液配制

2. 4 µl样本细胞（含PBS）加入微离心管。如果细胞不够4 µl，加PBS sc补齐。

注意：REPLI-g单细胞扩增试剂盒提供的PBS sc量不够用于样本细胞的连续稀释。

可以使用0.5 µl 全血。（Alternatively, 0.5 µl whole blood can be used.）

3.加入3 µl 配制的D2缓冲液。小心轻弹试管混匀，稍微离心。

注意：确保样本细胞没有贴在缓冲液线上的管壁。

4.65°C孵育10min。

1. 加入3 µl 终止液。小心轻弹试管混匀，稍微离心。冰上保存。

二 扩增

6.冰上解冻REPLI-g sc DNA聚合酶。其他成分室温解冻，漩涡振荡后稍微离心。

解冻后REPLI-g sc反应缓冲液可能会形成沉淀，漩涡振荡10s可以溶解沉淀。

7.按表2配制master混合液。混匀，稍微离心。

要点：严格按照表2所列顺序配制。加入水和反应缓冲液后，稍微漩涡振荡和离心后再加入DNA聚合酶。

注意：一次性进行多次反应时，根据反应数量等比例增加用量。DNA聚合酶加好后maste混合液要立即投入使用。

表2：master混合液配制

多次反应，根据反应数量等比例增加剂量并增加10%。

8.每次反应，10 µl 变性DNA（步骤5）加入40 µl master 混合液。

9.30°C孵育8h。

30°C孵育后，水浴或其他加热仪可以改设为65°C方便步骤10使用。

注意：如果使用带加热盖的热循环仪，盖子温度设为70°C。

10.DNA聚合酶65°C灭活3min。

扩增产物储存

11.如果不直接使用，扩增所得DNA 短期储存在4°C，长期储存在–20°C。

使用REPLI-g Single Cell Kit 单细胞全基因组扩增试剂盒的DNA可以当作基因组DNA（zui低冻融循环），因此推荐zui低核酸储存密度为100 ng/µl。

注意：避免多次反复冻融以确保DNA质量。

下游应用样本处理

12.依照说明书用水或TE适量稀释扩增DNA。用于PCR分析的扩增DNA按1:100稀释，每次PCR反应使用2 µl 稀释后DNA。

13.扩增DNA可用于一系列下游应用，包括：第二代测序，array CGH和定量PCR。

注意：每50 µl典型反应的DNA产量约40 µg，需要正确稀释。扩增DNA定量见附件A。

方法二：纯化基因组DNA扩增

略。详情参见原版说明书。中文版翻译可咨询红荣微再。

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