人维生素D(VD)ELISA检测试剂盒使用说明书
更新时间：2016-04-18 点击次数：2987次
人维生素D(VD)ELISA检测试剂盒使用说明书
检测原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被维生素D(VD)抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并*洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的维生素D(VD)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法:
1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。
3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。
5.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品
1.37℃恒温箱
2.酶标仪(450nm)
3.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
操作注意事项
1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶*溶解后再使用。
2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封(低温干燥)保存。
3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，zui终结果乘以5才是样本实际浓度。
4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5.所有液体组分使用前充分摇匀。
人维生素D(VD)ELISA检测试剂盒组成:
名称96孔配置48孔配置备注
微孔酶标板12 孔×8 条12 孔×4 条无
标准品0.3mL*6 管0.3mL*6 管无
样本稀释液6mL 3mL 无
检测抗体-HRP 10mL 5mL 无
20×洗涤缓冲液25mL 15mL 按说明书进行稀释
底物A 6mL 3mL 无
底物B 6mL 3mL 无
终止液6mL 3mL 无
封板膜2 张2 张无
说明书1 份1 份无
自封袋1 个1 个无
注：标准品(S0-S5)浓度依次为：0、3、6、12、24、48 ng/mL
试剂的准备:20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1:20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
洗板方法
1.自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。
2.手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。
操作步骤:
1.从室温平衡20min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL，15min 内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
结果判断:绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。
试剂盒性能:
1.准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.9900。
2.灵敏度：zui低检测浓度小于1.0 ng/mL。
3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4.重复性：板内、板间变异系数均小于15%。
5.贮藏：2-8℃，避光防潮保存。
6.有效期：6个月
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