一、满足抗体选择的基本条件

　　靶蛋白特异性：确定目的细胞的特异性表面标记或者胞内标记，知道您要检测什么。

　　种属：严格按照待测样本种属选择抗体来源，流式抗体基本无法进行种属间交叉反应。

　　应用领域：可用于流式实验，说明书中明确标注经FC实验测试，有实验数据图和用量说明;

　　抗体克隆号：一般选择参考文献上提到的克隆;同一抗体多个克隆号的情况下，可以选择荧光标记种类zui多的那个克隆。

　　二、确定流式细胞仪的参数配置

　　在设计流式方案前，根据可能需要同时检测指标的多少数量，先确定需要在哪台使用流式细胞仪检测的型号，对该仪器的参数配置，要了解以下几个方面信息：

　　激光器：常见的流式细胞仪有488nm和635nm633nm两个激光器，但有些机器在购买时因某些原因，只装了一个488nm激光器，所以需要注意型号相同的机器也未必激光配置相同。

　　滤光片：也就是有几个检测通道，这决定了你zui多可以同时检测几个指标。

　　仪器的具体型号：有助于再次确定检测通道。因为同一个荧光在不同的流式细胞仪上检测，有时候检测通道也是不一样的。

　　三、流式抗体使用剂量

　　同一个产品通常会提供多个规格供您选购，可以根据实验的具体样本量和说明书建议用量来确定抗体用量：

　　细胞数：通常情况下流式检测一次的样本量为106~108个细胞，建议对样本做细胞计数，以保证抗体标记效果*;

　　Test包装：以test为计量单位的抗体，按照每test细胞悬液体积计算出每次加入多少ul抗体即可;Ug包装：以ug为计量单位的抗体，需要根据说明书每次抗体加入多少ug先算出能使用的次数，再通过总体积算出每次加入多少ul抗体。

　　四、同型对照抗体的选择

　　同型对照(Isotype Control)，是用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色，是真正意义上的流式阴性对照，流式细胞实验*的一项。

　　来源：同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型及亚链、相同荧光标记的免疫球蛋白，也要求使用相同剂量。同型对照一定要选择准确，通常在荧光一抗的说明书中，厂家会给出同型对照抗体的货号;

　　纯化级别抗体：如果是纯化的一抗加荧光标记的二抗，那么应该选择与一抗相对应的同型对照抗体(如样品管为：纯化的CD3+PE标记的二抗+样本;则对照管为：纯化的同型对照+ PE标记的二抗+样本);

　　五、荧光的选择建议

　　直标还是间标(Biotin)：待测抗原表达高的尽量选择直标抗体，待测抗原表达丰度低的要考虑选间生物素标记标抗体。

　　荧光强弱：荧光本身有强弱之分，可视抗原表达强弱及分群情况选择合适的荧光。如抗原表达弱或分群不明显的建议选择强荧光例如：PE、APC;反之，抗原表达强或分群明显的建议选择zui常用的弱荧光例如FITC即可(常用荧光强弱排序程度为：PE>APC>PE-cy5Cy5>PercCPp-Cycy5.5>FITC)，具体荧光信息请参考荧光染料信息。

　　类似荧光的权衡：可以尝试选择新型荧光Alexa Fluor、eFluor等。因为这些荧光非常明亮，对激光稳定性好，对PH 值不敏感，具有水溶性。

　　六、多色荧光搭配的原则

　　多色分析方案中荧光抗体的选择和搭配，会受到很多因素的制约，是一个难点：

　　检测通道不能冲突：每个检测通道只能选择1种荧光素，各通道之间的荧光素可以随意搭配(如FL1选择了FITC标记的抗体，就不能再选择Alexa Fluor488标记的抗体;而同组实验的其余抗体选择PE或者APC标记，都是可以随意组合的);

　　荧光强弱：所选各种荧光素光谱的重叠应当尽量减少，否则将会导致较大的补偿。例如，PE-Ccy5与APC同时标记，将会导致补偿过度，需换成PE-Ccy5.5或PerCPcp-Ccy5.5。zui常用的4色荧光搭配是：FITC、PE、PercpPerCP-Ccy5.5、APC;

　　多色荧光搭配：多色分析往往会因个别抗体荧光素种类极少而受到限制，需要同时参考多家抗体公司的产品进行方案设计。

　　流式抗体的使用事项

　　1.建议实验细胞的数量和抗体的比例要适当。细胞过量或抗体过量都可能使实验结果受影响，因此需要优化试验条件。注：不同的流式技术对抗体的需求量有较大差异，例如传统流式细胞术(采用鞘液流系统)需要1×106个细胞为起始上样量，抗体用量为10μl，而微流式细胞术则只需5×105个细胞，抗体用量减少到5μl。

　　2.直标的流式抗体应该4℃避光保存，不要冷冻。尽量选择经实验验证的流式抗体，以保证实验结果。