转染试剂盒的标准操作步骤
更新时间:2016-01-27 点击次数:2276次
转染试剂盒可用于转染的细胞包括各种细胞株和原代细胞,例如成纤维细胞,成肌细胞,间充质干细胞,上皮细胞等等。转染试剂盒都经无菌处理,并通过严格质量检验,可以直接使用。转染试剂盒可在室温(15~25℃)保存三个月,4℃保存一年,-20℃保存一年以上。
转染试剂盒的标准操作步骤:
1. 使用前预热试剂至常温。
2. 转染前一天,接种适量细胞悬液至100-mm培养皿、60-mm培养皿或6孔板中,放置到潮湿37°C 5% CO2 培养箱培养过夜。
3. 次日,吸去细胞培养液,加入新鲜培养液。
4. 取两根无菌1.5ml eppendorf管,分别记为A、B。按下表,根据培养皿不同而加入不同体积的试剂:
5. 用移液管混匀B管中溶液并将B管中溶液轻轻逐滴加入到A管中。用气泡法混匀转染混合物,这一步尽量在2分钟内完成,室温孵育30分钟。
6. 将混合物逐滴加入到细胞中,轻轻摇晃培养皿使混合物均匀分布在细胞表面。
7. 放置到潮湿37°C、5%CO2培养箱中培养过夜。
8. 次日早上用新鲜培养基更换细胞培养液,于37℃ 5%CO2培养箱中继续培养24-48h。
9. 检验转染效率(如荧光观察,蛋白质印迹等)。
转染试剂盒使用注意事项:
转染前以细胞融合度不超过80%为宜,接种密度因所采用的细胞系和细胞的倍增时间而有所不同。
高纯度的质粒是获得高转染效率的必要条件,要确保A260/A280大于1.8,并且电泳检测抽提到的质粒90%以上都是超螺旋。
转染时,B管中溶液轻轻逐滴加入到A管中,请勿混乱顺序。
溶液的pH值关系到转染效率,尽量避免把转染试剂盒的溶液长时间暴露在空气中,以免被空气中的二氧化碳酸化。
转染时由于质粒不同、细胞不同,*的质粒用量需自行摸索。
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