RNA-seq及其分析是近年来最火的研究方向之一，想要详细了解RNA-seq的原理，最好先自行了解一下在此之前的各种测序技术，下面给出了测序技术的大致发展历程。
测序技术发展：
1977Sanger测序--1996焦磷酸测序--2003cmPCR--2003ZMW---2012纳米孔测序--now第二代测序(NGS)
第一代测序技术(Sanger测序)虽然有测序读长(可达1000bp)、测序准确率(高达99.999%)的优点，但是其测序成本高、通量(仪器一次测序产生的总数据量)低等缺点导致无法大规模应用。
第二代测序技术(NGS)有测序速度快、测序成本低、准确性高的优点，但其测序读长比第一代测序技术要短很多(一般100-150bp)。目前illumina是NGS的主流公司(采用Hisq技术)，其仪器的方法都是边合成边测序。
RNA-seq（RNA sequencing）是一种利用高通量测序技术来测定RNA样本的方法，它可以提供关于转录组的详细信息，包括mRNA、microRNA、lncRNA等不同类型的RNA分子的表达水平、剪接变异、融合转录本以及新的转录本等。以下是RNA-seq的基本步骤和技术原理：
样本准备：
总RNA提取：首先从样本中提取出总RNA，这一步通常需要使用商业化的RNA提取试剂盒。
rRNA去除：由于rRNA在总RNA中占比很大，因此通常需要去除rRNA以提高后续测序的效率。这可以通过多种方法完成，例如使用特异性引物的寡聚dT磁珠捕获poly(A)+ mRNA或使用rRNA特异性探针进行杂交捕获。
cDNA文库构建：
反转录：使用逆转录酶将mRNA转换成cDNA。
文库片段化：如果需要，可以通过超声波或酶处理将cDNA片段化。
接头连接：在cDNA片段的两端加上测序接头，以便于后续的测序过程。
PCR扩增：通过PCR扩增文库，增加文库的拷贝数，同时也可以在此步骤中引入索引（index）以便进行多重测序。
测序：
使用高通量测序平台（如Illumina、Thermo Fisher的Ion Torrent或PacBio等）对文库进行测序。目前最·常用的测序技术是基于Illumina平台的短读长测序，可以产生几十到几百碱基长度的序列片段。
数据处理和分析：
原始数据质控：对原始的测序数据进行质量控制，去除低质量的reads。
序列比对：将测序得到的reads与参考基因组或转录组比对，确定它们在基因组中的位置。
表达量化：根据比对结果，计算每个基因或转录本的表达水平，常用的方法有FPKM (Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads) 或TPM (Transcripts Per Million)。
差异表达分析：比较不同条件下的样本，找出差异表达的基因。
其他高级分析：还可以进行剪接变异检测、新转录本预测、非编码RNA分析等。
整个RNA-seq流程涵盖了从样本处理到数据分析的多个步骤，每一环节都需要细致的操作和严谨的数据处理。随着技术的发展，RNA-seq已经成为转录组研究中不·可·或缺的工具，广泛应用于生物学、医学、农业等多个领域。
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