说完磁珠法,今天带大家看一下同样常用的TRIzol法核酸提取,适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌,样品量从几十毫克至几克,常用于从组织和细胞中分离和纯化RNA,拒绝蛋白和DNA污染。
实验原理:
RNA质量的高低常常影响cDNA库,RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶。TRIzol使样品匀浆化,细胞裂解,溶解细胞内含物,同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后,溶液分为水相和有机相,RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA;用乙醇沉淀中间层可回收DNA;用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。
实验步骤:
1、将组织在液氮中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
2、研磨液室温放置5分钟,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒。
3、取上层水相于一新的离心管,按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟。
4、弃去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4℃下7500g离心5分钟。
5、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中,必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
[注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作。
2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,-20℃保存一年。
3.由于样本性质和数量的区别,在样本取样后处理方式均有不同,红荣微再有专业的技术岗位为您保驾护航,为您解决试剂使用过程中出现的问题,保证实验成果。
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品牌 货号 名称 规格
thermo Invitrogen 15596026 TRIzol™ 试剂 100mL
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