如何做好RNA提取
RNA定义:
RNA作为重要的生物大分子,是生命现象的分子基础之一。mRNA在信息传递中起很重要的作用ea6d18。其它两大类RNA,rRNA和tRNA,同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。很多实验中也需要提取相应样本的RNA作为实验原料。
提取方法:
1.Trizol法异硫氰酸胍/苯酚法
TRIzol试剂有多组分分离作用,最大特点就是可同时分离一个样品RNA/DNA/蛋白质。TRIzol使样品匀浆化,细胞裂解,溶解细胞内含物,同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后,溶液分为水相和有机相,RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA,用乙醇沉淀中间层可回收DNA,用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。
2.CTAB法
影响因素:
1.样本材料:
●建议使用新鲜材料。切记使用反复冻融的材料。
●材料长期保存建议液氮,—80℃短期保存
2.样本处理:
根据不同材料选择不同的样本处理
●培养细胞:通常可直接加裂解液裂解
●酵母和细菌:直接液氮研磨,之后用Trizol裂解
●动植物组织:先液氮研磨和匀浆,后加裂解液裂解。
纯化方案:
●经典的沉淀方法,虽然经济,但操作时间长,易造成 RNA 降解;
●离心柱式纯化方法:抽提速度快,能有效去除影响后续RNA酶反应的杂质。
●磁珠法:同时兼具了样本需求低、操作方便、适配全自动化等优点,目前是尤为常用的核酸纯化方法。
常见问题:
1.RNA降解
●样品取样以及保存是否得当
●裂解液的质量
●外源RNase的污染
●裂解液的用量不足
●组织裂解不充分
●另外某些富含内源酶的样品(如脾脏,胸腺等),很难避免RNA 的降解。
2.OD260/OD280<1.65
●检测吸光度时,RNA样品没有溶于水,而溶于了TE中。低离子浓度和低PH值条件下OD280值偏高;
●样品匀浆时加的试剂量太少或样本量过多;
●吸取水相时混入了有机相;
●RNA沉淀未*溶解。
3.RNA总量低
●样本选择问题:样本自身丰度不足
●样品裂解或匀浆处理不*;
●RNA沉淀未*溶解。
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