个要给大家讲的,是它这个flowcell。Flowcell翻成中文,就叫“流动池”。
我们来看这个图片。图片当中,我们看到一个象载玻片大小的芯片。这个芯片里面,是做了8条通道。在这个通道的内表面,是做了专门的化学修饰。它的化学修饰,主要是用2种DNA引物,把它(2种DNA引物)种在玻璃表面。
这两种(DNA引物的)序列是和接下来要测序的DNA文库的接头序列相互补的。而且这2种引物是通过共价键,连到Flowcell上去。之所以要用共价键连到Flowcell上去,是因为接下来有大量的液体要流过这个Flowcell,只有有共价键连接的这些DNA,才不会被冲掉。这就是Flowcell。
文库制作
再接下来,讲一下文库、和文库的制作(过程)所谓的DNA文库,实际上是许多个DNA片段,在两头接上了特定的DNA接头,型成的DNA混合物。
文库有2个特点,第1个特点,是当中这一段插入的DNA,它的序列是各种各样的。第2个特点,它的两头的接头序列,是已知的,而且是人工特地加上去的。要做这个文库,首先是把基因组DNA,用超声波打断。然后打断之后,两头用酶把它补平,再用Klenow酶在3'端加上一个A碱基。然后,再用连接酶把这个接头给连上去。
连好了接头的DNA混合物,我们就称为一个“文库”。英文也称作“library”。
桥式PCR
做好了Library之后,就要做桥式PCR了。桥式PCR,实际上是把文库种到芯片上去,然后进行扩增,这样的一个过程。
这个过程,首先是把文库加入到芯片上,因为文库两头的DNA序列,和芯片上引物是互补的,所以,就会产生互补杂交。
杂交完了之后,我们在这里面加入dNP和聚合酶。聚合酶会从引物开始,延着模板合成出一条全新的DNA链来。
新的这条链,和原来的序列是*互补的。
接下来,我们再加入NaOH碱溶液。DNA双链在NaOH碱溶液存在下,就解链了。而且被液流一冲,原来的那个(模板)链,也就是没有和芯片共价连接的链,就被冲走了。而和芯片共价连接的链,就被保留下来。
然后,我们再在液流池里加入中性液体,主要是为了中和这个碱液,在加入中和液之后,整个环境变成中性了。这时侯,DNA链上的另外一端,就会和玻璃板上的第二种引物,发生互补杂交。
接下来,我们加入酶和dNTP,聚合酶就延着第二个引物,合成出一条新链来;然后,我们再加碱,把2条链解链解开;然后,我们再加中和液,这时侯,DNA链会和新的引物杂交。再加酶,再加dNTP,又从新引物合成出新的链来。
连续重复这一过程,DNA链的数量,就会以指数方式增长。
制备单链
在桥式PCR完成之后,接下来要做的工作,就是要把合成的双链,变成可以测序的单链。
办法是通过一个化学反应,把其中一个引物上的一个特定的基团给切断掉。
然后,再用碱溶液来洗这个芯片。这时侯,碱让DNA的双链解链,那根被切断了根的DNA链就被水冲掉了。留下那根共价键连在(芯片)上面的链。
接下来,再加入中性溶液,然后在这个中性溶液里面加入测序引物。
正式测序
好,接下来正式的测序工作就开始了。
那么,在测序的时侯,加入进去的,主要是2个东西:一个是带荧光标记的dNTP。而这个dNTP,它还有一个特点,它的3'末端是被一个叠氮基堵住的。
然后,再加一个聚合酶,聚合酶就会选择:哪一个dNTP是和原来位置上的那个碱基是互补的,根据互补性原理,把这个dNTP合成到新的这个DNA链上去。
因为这个dNTP的3'端是被一个叠氮基团堵住了,所以,它一个循环只能延长一个碱基。然后,它就停在那儿了。
合成完了之后,就用水把多余的dNTP和酶给冲掉。
冲掉之后,就放到显微镜下,去进行激光扫描。根据发出来的荧光来判断它是哪个碱基。
因为4种dNTP,它每一种dNTP上面标的荧光素都不一样,根据红、黄、蓝、绿,它出来的哪种颜色,那么,就可以倒过来推出来,这个新合成上去的碱基,是哪种碱基。
因为新合成的碱基,是和原来位置(的碱基)是互补的,所以,又推出模板上那个碱基是哪个。
这一个循环完成之后,就加入一些化学试剂,把叠氮基团和旁边标记的荧光基团切掉。切完了之后,3'端的羟基就暴露出来。
再接下来,加入新的dNTP和新的酶,然后,又延长一个碱基。新延长完一个碱基之后,把多余的酶和dNTP冲掉,再进行一轮显微的激光扫描,再读一下这个碱基是什么。
不断重复这个过程,可以重复上百次,到几百次,就可以把上百个碱基,甚至更多碱基的序列读出来。
读Index
那么,什么是Index哪?是因为Illumina的评委会个测序量很大,往往一个样本,用不了那么几亿条DNA。所以,科学家就想了一个办法。在文库的接头上做了一些标记,每一个样本,它有一个特定的接头,每个接头里面,它有一段特定的序列。
这段特定的序列,我们就称为Index。也有人把它叫做Barcode,反正,表达的是一个意思:这么一段特定的序列,标记了样本的来源。
那么,要读这个Index的序列,先用碱把上面这根测完“Read1”的序列,把上面这根DNA链给解链掉。
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