脐带除了提取造血干细胞用于细胞治疗外，华通氏胶等基质部分还能提取间充质干细胞，因其MSC的密度较高，为组织修复等需要间充质干细胞的临床治疗带来便利。

一 人脐带间充质干细胞无血清培养文献

人脐带间充质干细胞的贴壁培养方法主要区别是培养基的选择。

搜索方法

使用题名“脐带+间充质干细胞+培养”，摘要“无血清”在中国知网搜索。

使用(Umbilical Cord[Title] AND Mesenchymal Stem Cells[Title]) AND serum free[Title/Abstract] 在Pubmed搜索。

文献及要点（按发表时间） 脐带间充质干细胞无血清培养

1 无血清培养体系相较于人血小板裂解液培养体系能一定程度上提高间充质干细胞的体外增殖能力。

2 无动物源成份无血清培养基（自制）可支持脐带间充质干细胞的体外扩增,维持其免疫学表型及分化潜能,提供数量充足的高质量间充质干细胞,满足临床治疗及生物医学研究的需要。

3 无血清与含胎牛血清培养基所培养的人脐带间充质干细胞在细胞形态、增殖活性、表面标记和分化潜能相似;但在无血清培养基成分中无动物源蛋白引入,是更理想的人脐带间充质干细胞培养基种类。

4 利用无血清培养体系获得的人脐带间充质干细胞治疗代偿性乙型肝炎肝硬化是安全的,部分患者有效,但其长期的安全性和有效性有待进一步研究证实。

5 无血清培养液培养的人脐带细胞均为MSC（间充质干细胞）,有传代增殖潜能,传代可达临床治疗MSC细胞量,并可避免异种蛋白致敏。

6 利用酶消化法和无血清的培养体系能够快速分离培养出大量hUCMSCs（人脐带间充质干细胞）,该方法扩增得到的间充质细胞具备稳定的细胞标记物和生长状态,可用于各种治疗的临床试验。

7 无血清培养体系可以保持间充质干细胞（来源：脐带华通氏胶）的特性,为替代含血清培养体系进行脐带间充质干细胞原代培养提供了可能。

8 脐带不同组织来源的MSC的生物学特性及免疫调控作用与骨髓来源的MSC无明显差异,但在支持造血的功能有所不同,随着对MSC研究的不断深入,其应用的范围将更为广泛。

9 利用无血清的人间充质干细胞培养基培养体系,脐带组织培养法能够分离培养出大量的脐带间充质干细胞,避免了培养中异种蛋白的混入而降低临床排异反应。

英文版（按发表时间）

10 无血清培养基中，胰岛素促进脐带基质间充质干细胞的扩增和生长。

11 脐带华通氏胶间充质干细胞3D分化无血清培养条件：生长因子、细胞因子和小分子。

12 使用无血清培养基培养原代人脐带间充质干细胞。

13 使用MesenCult-XF 培养基培养人脐带间充质干细胞。

14 MesenCult-XF无血清培养基培养人脐带间充质干细胞25代的情况。

15 使用无动物源、无血清培养基培养人脐带间充质干细胞，不影响MSC的表型和分化潜能。

结论

采用无血清培养基可以进行人脐带间充质干细胞的原代及传代培养，同时保有MSC的表型和分化潜力。

二 商用人间充质干细胞无血清培养基

 人间充质干细胞培养基的发展

 *代 培养基+牛血清

 第二代 培养基+牛血清替代品：人血清、血小板裂解液   和脐带血清

 第三代 无血清、无动物源、成分确定的培养基

第三代人间充质干细胞培养基不含牛血清或人血清之类的血清替代品，无动物源而且成分确定，免除了异种血清带来的病原体污染风险，而且批次稳定，适合干细胞治疗的临床研究。

品牌      货号         产品描述

HY StemCell  HX0201M       CCGmHuMTM  Human MSCs Medium 人间充质干细胞无血清培养基，成分确定、无动物源

StemCell    05420       MesenCultTM-XF Medium，Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells 人间充质干细胞培养基，成分确定、无动物源

StemRD     MGro-500     MSC medium,chemically-defined, xeno-free人间充质干细胞无血清培养基，成分确定、无动物源

LONZA      12-725F    UltraCULTURETM Serum-free Medium无血清培养基

文献目录及中文摘要

[1]孙亚如,张炳强,王福斌,许评,王二朴,李翠翠.培养体系对维持人脐带间充质干细胞特性及其体外扩增效率的影响[J].中国组织工程研究,2017,21(13):2023-2028.

摘要：背景:前期数据显示,应用人血小板裂解液培养体系对人脐带间充质干细胞进行体外培养时,较无血清培养体系能更好地维持干细胞特性,而无血清培养体系相较于人血小板裂解液培养体系能一定程度上提高间充质干细胞的体外增殖能力。目的:筛选能zui大限度维持人脐带间充质干细胞特性及扩增效率高的培养体系。方法:将6份人脐带标本分别接种于6种培养体系中,进行脐带间充质干细胞原代培养,6种培养体系分别为MesenC ult无血清*培养基中添加2%人血小板裂解液(A组)、StemPro无血清*培养基中添加2%人血小板裂解液(B组)、MesenC ult无血清*培养基(C组)、Stem Pro无血清*培养基(D组)、低糖DMEM中添加体积分数10%胎牛血清(E组)、低糖DMEM中添加10%人血小板裂解液(F组),14 d后进行消化传代培养,比较各培养体系对人脐带间充质干细胞形态、表面标记物、分化及增殖能力的影响。结果与结论:(1)D组第3代细胞细长,大小不均;E、F组第3代细胞扁平,其余组第3代细胞为长梭形且大小较均一。A、B组第5代细胞形态及大小较第3代时无明显变化,C组第5代细胞趋于扁平且大小不均一,D组第5代细胞形态较第3代时细长,E组第5代细胞形态较第3代时扁平,F组第5代细胞形态较第3代时无明显变化;(2)各组细胞表面标志物检测结果无明显区别;(3)A、B组成脂、成骨诱导率较高,E、F组次之,C、D组zui低;(4)A组各代次细胞扩增数量显著高于C组,B组各代次细胞扩增数量显著高于D组,E、F组扩增数量显著低于培养组A、B组;(5)结果表明,无血清和人血小板裂解液相结合的培养基能较好地维持间充质干细胞的特性及扩增效率

[2]任春红,张昕.无动物源成分培养基用于人脐带间充质干细胞培养的研究[J].延安大学学报(医学科学版),2015,13(01):1-4.

摘要：目的建立一种无动物源成份无血清的间充质干细胞培养基XF/SF-MSCM,并探讨其支持人脐带间充质干细胞(h UC-MSCs)体外增殖、维持分化潜能的效果。方法组织块贴壁法分离获得原代人脐带间充质干细胞,P1代起分别使用自制的XF/SF-MSCM培养基与含10%胎牛血清的传统培养基(SC-MSCM)对脐带间充质干细胞进行连续培养传代至P6代,观察比较两组P6代细胞的形态及增殖能力,以流式细胞术检测连续传代后细胞的免疫学表型,比较其成骨、成脂肪的分化潜能。结果分离获得的原代P0脐带间充质干细胞,分别在XF/SFMSCM与SC-MSCM两种培养基中连续培养传代,细胞增殖能力及形态无显著差别。两组P6代细胞的生长曲线相似,但XF/SF-MSCM组间充质干细胞贴壁的紧密程度稍低;流式细胞检测结果显示,XF/SF-MSCM组细胞保持了间充质干细胞的免疫学表型,高表达CD29、CD44、CD90,不表达CD31、CD34、CD45并维持了良好的成骨和脂肪细胞的分化能力。结论本室制备的无动物源成份无血清培养基XF/SF-MSCM可支持脐带间充质干细胞的体外扩增,维持其免疫学表型及分化潜能,提供数量充足的高质量间充质干细胞,满足临床治疗及生物医学研究的需要。

[3]陈林,张坤,董伟,杨珂,艾辉,陈禄华.脐带间充质干细胞无血清和含胎牛血清培养体系比较[J].重庆理工大学学报(自然科学),2014,28(09):57-61+86.

摘要：为了比较在无血清与含胎牛血清培养基中人脐带间充质干细胞的增殖能力、生物学特性、分化潜能,将脐带华通氏胶剥出剪碎,分别在无血清与含胎牛血清培养基中培养扩增脐带间充质干细胞。用MTT法检测细胞增殖活性,并绘制生长曲线;在倒置显微镜下对细胞形态进行观察;利用流式细胞仪检测鉴定其表面标记CD73,CD90,CD105,CD14,CD34,CD45,CD79a及HLA-DR的表达;将成骨及成脂诱导液培养1~2周后观察其细胞形态学变化,用碱性磷酸酶染色鉴定其成骨情况,油红O染色鉴定其成脂情况。结果表明:无血清与含胎牛血清培养基所培养的人脐带间充质干细胞在细胞形态、增殖活性、表面标记和分化潜能相似;但在无血清培养基成分中无动物源蛋白引入,是更理想的人脐带间充质干细胞培养基种类。

[4]邓福珠,毕晓云,何蓉,黄舒,陈晶砺,陈嘉榆,王恒湘,郭子宽.无血清培养的脐带间充质干细胞治疗乙型肝炎肝硬化的临床观察[J].组织工程与重建外科杂志,2014,10(03):141-144+167.

[5]周平,李丹,陈广华,王易.无血清培养脐带间充质干细胞的研究[J].中国实验血液学杂志,2013,21(05):1256-1260.

摘要：本研究观察无血清培养液培养的人脐带间充质干细胞(UC-MSC),并比较与含10%胎牛血清培养液培养的人脐带间充质干细胞的异同。采集正常足月剖宫产胎儿脐带,用MesenCult-XF无血清培养液或含10%胎牛血清培养液培养。观察不同培养液培养的间充质干细胞细胞的形态、免疫表型、细胞周期、增殖分化潜能及对混合淋巴细胞反应的抑制作用。结果表明,采用无血清MesenCult-XF培养液培养的MSC平均传代倍增6.57±0.7倍,含血清培养液培养的MSC平均传代倍增4,59±0.45倍(P<0.05);两种培养液培养的MSC均表达CD44、CD90、CD73、CD105抗原,不表达CD31、CD45、HLA-DR及CD34等抗原,表达程度无明显统计学差异;无血清培养液培养的MSC(65±5.2)%均为G o/G1期细胞,含血清培养液培养的MSC(62±3.1)%为G o/G1期细胞(P>0.05);两种培养液培养的人脐带MSC均可向成脂细胞、成骨细胞分化;无血清培养液培养的脐带MSC按1 000、5 000、10 000、20 000个细胞/孔接种密度与反应细胞和刺激细胞共培养的每分钟闪烁值(CPM)分别为(6.43±0.47)×104、(4.30±0.38)×104、(1.97±0.13)×104和(0.24±0.03)×104,含血清培养液培养的MSC与不同密度的混合淋巴细胞共培养的CPM值分别为(7.85±0.07)×104、(5.64±0.12)×104、(3.09±0.18)×104和(1.73±0.05)×104。结论:无血清培养液培养的细胞均为MSC,有传代增殖潜能,传代可达临床治疗MSC细胞量,并可避免异种蛋白致敏。

[6]李兰兰,马炬明,陈玲肖.脐带间充质干细胞无血清培养的实验研究[J].中国现代医生,2013,51(27):85-87.

摘要：目的建立一种简单的体外无血清培养扩增人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)的方法。方法利用酶消化法分离hUCMSCs,在无血清干细胞培养体系下培养扩增,进行形态学观察,CCK-8法分析细胞生长曲线,流式细胞仪分析细胞表面抗原表达及细胞周期,进行成骨、成脂诱导分化。结果 hUCMSCs呈典型的成纤维细胞形态,具有较强的增殖能力。CD29、CD44、CD90、CD105均呈阳性表达,而CD34、CD45呈阴性表达。3周可诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞。结论利用酶消化法和无血清的培养体系能够快速分离培养出大量hUCMSCs,该方法扩增得到的间充质细胞具备稳定的细胞标记物和生长状态,可用于各种治疗的临床试验。

[7]周婷婷,卫超,陈晓东,李海,汪铮.无血清培养体系原代培养脐带间充质干细胞[J].中国组织工程研究,2013,17(27):4980-4987.

摘要：背景: 以含血清培养基培养的脐带间充质干细胞,存在着进一步应用的障碍。目的: 建立无血清培养体系原代培养脐带间充质干细胞。方法: 取脐带华通氏胶(Wharton’sJelly),采用机械法将组织胶切碎,1-3mm3大小,分别培养到含胎牛血清*培养液中以及无血清培养液中。培养第11,14,17天收获细胞并进行相关检测。在符合2006年制定的干细胞zui低评估标准的基础上,以集落形成单元指标评估何种培养体系能获得较多高质量的原代细胞。结果与结论: 无血清培养体系相对于经典的含血清的培养体系而言,细胞生长速度更快。另外,培养第11天,集落形成实验表明无血清培养体系下能获得更多的集落。因此,无血清培养体系可以保持间充质干细胞的特性,为替代含血清培养体系进行脐带间充质干细胞原代培养提供了可能。

[8]徐曼. 人脐带不同组织来源间充质干细胞的分离培养及其免疫调控能力和支持造血的实验研究[D].2011.

摘要：间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是来源于发育早期中胚层的具有高度自我更新和多向分化潜能的多能干细胞,广泛存在于全身多种组织中。大量研究证明,MSC具有低免疫原性、多向分化潜能、调节免疫以及分离培养操作简便等特点。MSC的临床研究已经在许多国家开展,作为种子细胞,临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤等多种难治性疾病,如脊髓损伤、脑瘫、肌萎缩侧索硬化症、中风、糖尿病、糖尿病足、肝硬化等;作为免疫调节和造血支持细胞,用于治疗免疫排斥和自身免疫性疾病,如系统性红斑狼疮、系统性硬化症、克隆氏病等。MSCzui早在骨髓中发现,但骨髓中含量极少,且骨髓源性MSC存在高度病毒污染的可能,并且随着年龄的增长其细胞数量和扩增分化能力亦显著降低。近年来,国内外大量研究证明脐带作为胎儿发育的一部分,含有大量的多能干细胞,细胞生长扩增速度快,且脐带属于胚胎外组织,在胎儿娩出后成为“废弃物”,取材方便,来源丰富,无伦理学问题,因此,被看作是骨髓间充质干细胞的主要替代品,具有巨大的临床应用价值。不同学者分别从整条脐带、脐带的基质、脐静脉内皮中分离获得MSC,还有为数不少的学者从胎盘羊膜中分离获得MSC。考虑到脐带组织构成简单,包括表皮(羊膜上皮细胞)、基质(Wharton’s jelly)及血管,既无毛细血管也无淋巴管,但其超微结构、免疫组化和活体功能研究显示,羊膜下、血管间和血管周围区域在细胞数量和特性上均有显著差异,为此,我们拟将这三种组织分开,从中分别分离、培养、扩增MSC,并研究其生物学特性、免疫调控能力及造血支持作用,为临床应用提供重要依据。首先,我们通过机械分离及胶原酶消化法分别从人脐带的羊膜(Amnion)、基质(Wharton’s jelly)及血管(Vessel)中获得组织细胞,通过反复贴壁纯化获得AM-MSC、WJ-MSC、VS-MSC;从整条脐带(Umbilical cord)中获得UC-MSC;通过密度梯度离心法从骨髓(Bone marrow)中分离得到单个核细胞,同样通过反复贴壁纯化获得BM-MSC。然后,从细胞形态、细胞生长曲线、细胞周期、多向分化潜能特性及细胞免疫表型五个方面进行比较和鉴定。结果表明,五组MSC具有相似的生物学特征:1)细胞培养至第3代细胞形态相对均一,为典型的成纤维样,呈平行或漩涡状排列;2)细胞具有强大的体外扩增能力;3)均有80%以上的细胞处于G0/G1,提示脐带不同来源的MSC同BM-MSC一样均具有典型的干细胞增殖特点,即只有少数细胞处于活跃的增殖期;但BM-MSC的培养需添加低浓度的细胞生长因子bFGF,且培养至5代后扩增能力逐渐减低,而脐带来源的MSC仅在低营养条件下即能大量扩增,传代至第14代,细胞生物学特性无明显改变;4)对其诱导多向分化,结果表明,细胞可向成骨、成脂肪和成软骨方向分化,但与BM-MSC相比脐带来源的MSC成骨能力略低,脐带来源的MSC各组间无差异;5)流式细胞仪检测细胞免疫表型,结果表明,脐带不同组织来源的MSC同BM-MSC类似,均表达间充质干细胞特异性抗原CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166、HLA-ABC及多能干细胞标志物TRA-1-60,低表达或不表达造血及内皮细胞表面标志即CD14、CD31、CD34、CD45,以及移植免疫排斥相关的表面标志HLA-DR、CD80、CD86、CD40、CD40L;各组细胞表型进行比较,CD166表达有显著差异,CD31、CD106、HLA-DR的表达具有高度的显著差异。其次,通过淋巴母细胞转化实验及混合淋巴细胞反应检测其免疫调控能力。结果表明,对于有丝分裂原及异体抗原诱导的T淋巴细胞的增殖各组MSC均有抑制作用,且这种抑制作用具有剂量依赖性,随MSC的细胞数量逐渐增加,其抑制效应逐渐增强;实时定量PCR和RT-PCR方法检测与免疫相关的细胞因子IL-10、IL-11和TGF-β1的表达亦无显著差别,但UC-MSC组分泌的IL-6与WJ-MSC、VS-MSC、AM-MSC、BM-MSC组相比差异极其显著(P=0.0000),WJ-MSC与AM-MSC相比也有明显差别(p=0.008)。zui后,探讨脐带不同组织来源的MSC的造血支持作用。以脐带不同组织来源的MSC为饲养层,与脐带血造血干/祖细胞在无血清培养体系下共培养7天,检测有核细胞、CD34+细胞和造血集落的扩增效率。结果显示,MSC可以在体外有效支持造血干/祖细胞的扩增,与对照组相比差异高度显著;且UC-MSC组的有核细胞、CD34+细胞及CFU-C的扩增效率均显著高于WJ-MSC、VS-MSC和AM-MSC组,多能干细胞集落CFU-Mix的扩增效率未见显著差异;后三者之间进行比较,WJ-MSC组和VS-MSC组对红系祖细胞及粒、单核系祖细胞的扩增效率高于AM-MSC组,且经实时定量PCR和RT-PCR方法检测MSC分泌的造血生长因子的mRNA相对表达量,其差异也支持了这一结论,其中IL-3、IL-11、HGF、TPO、EPO、VEGF、M-CSF和G-CSF的表达水平无显著差异,而UC-MSC组IL-6、SCF、FLT3、LIF的表达量显著高于其它各组。上述结果提示,脐带不同组织来源的MSC的生物学特性及免疫调控作用与骨髓来源的MSC无明显差异,但在支持造血的功能有所不同,随着对MSC研究的不断深入,其应用的范围将更为广泛。而作为种子细胞,不同组织来源的MSC的功能亦有不同,值得我们进一步深入探讨和研究。

[9]方彦艳,马健.无血清培养基分离培养脐带间充质干细胞的研究[J].同济大学学报(医学版),2010,31(05):21-24.

摘要：目的探讨应用无血清培养体系分离培养脐带间充质干细胞,明确其成骨生物学特性,为临床应用奠定实验基础。方法在无血清干细胞培养体系下,利用组织块贴壁培养法分离培养,扩增脐带间充质干细胞,在倒置显微镜进行形态学观察,流式细胞检测鉴定其表面标记CD34、CD44、CD90及CD45的表达,成骨诱导液培养2～3周后观察其细胞形态学变化,茜素红染色鉴定其成骨情况。结果脐带组织块接种后第1次更换培养液12h后,有少量梭形的细胞从脐带组织边缘爬出,培养5～6d左右成单层状生长,12d左右梭形状细胞呈现复层生长趋势,细胞表面标记CD44、CD90均呈阳性为间充干细胞来源,CD34、CD45均呈阴性为非造血干细胞来源;细胞经成骨诱导2～3周后具有良好的分化成骨能力。结论利用无血清的人间充质干细胞培养基培养体系,脐带组织培养法能够分离培养出大量的脐带间充质干细胞,避免了培养中异种蛋白的混入而降低临床排异反应。

10.Insulin Promotes the Proliferation of Human Umbilical Cord Matrix-Derived Mesenchymal Stem Cells by Activating the Akt-Cyclin D1 Axis.

Li P, Wei J, Gao X, Wei B, Lin H, Huang R, Niu Y, Lim K, Jing K, Chu J.

Stem Cells Int. 2017;2017:7371615. doi: 10.1155/2017/7371615. Epub 2017 Apr 18.

11.Defined three-dimensional culture conditions mediate efficient induction of definitive endoderm lineage from human umbilical cord Wharton's jelly mesenchymal stem cells.

Al Madhoun A, Ali H, AlKandari S, Atizado VL, Akhter N, Al-Mulla F, Atari M.

Stem Cell Res Ther. 2016 Nov 16;7(1):165.

12.Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance.

Li Y, Guo G, Li L, Chen F, Bao J, Shi YJ, Bu H.

Cell Tissue Res. 2015 May;360(2):297-307. doi: 10.1007/s00441-014-2055-x. Epub 2015 Mar 8.

13.Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells do not undergo malignant transformation during long-term culturing in serum-free medium.

Chen G, Yue A, Ruan Z, Yin Y, Wang R, Ren Y, Zhu L.

PLoS One. 2014 Jun 2;9(6):e98565. doi: 10.1371/journal.pone.0098565. eCollection 2014.

14.Monitoring the biology stability of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells during long-term culture in serum-free medium.

Chen G, Yue A, Ruan Z, Yin Y, Wang R, Ren Y, Zhu L.

Cell Tissue Bank. 2014 Dec;15(4):513-21. doi: 10.1007/s10561-014-9420-6. Epub 2014 Jan 10.

15.Umbilical cord tissue-derived mesenchymal stem cells grow best under GMP-compliant culture conditions and maintain their phenotypic and functional properties.

Hartmann I, Hollweck T, Haffner S, Krebs M, Meiser B, Reichart B, Eissner G.

J Immunol Methods. 2010 Dec 15;363(1):80-9. doi: 10.1016/j.jim.2010.10.008. Epub 2010 Oct 28.