人外周血TH1/TH2/TH17染色
Tips：采集外周血的抗凝管必须是肝素抗凝管，刺激剂尽量选用冻干粉自己配置；cocktail刺激剂是液体形式，PMA会因保存不当导致活性降低，影响刺激效果，而冻干粉形式的PMA较稳定，可以保证刺激效果。
人外周血TH1/TH2/TH17染色/流式检测
细胞刺激：（刺激体系1ml）
取人外周血（肝素抗凝）200 ml加入24孔板内，加入800 ml的*培养基，再加入1ml PMA(25ug/ml)、1μl Ionomycin（1mg/ml），轻轻吹打混匀细胞。放入 CO2培养箱培养刺激0.5小时后，每孔再加入2μl Brefeldin A（5mg/ml），轻轻吹打混匀细胞，放入CO2培养箱培养刺激3.5小时。
流式检测：
1、收集细胞于流式管内，500 g/8min离心，枪头吸去上清，弹散管底沉淀，加入相应的表面染色抗体（CD3\CD8），弹散混匀。室温避光孵育15分钟后，500 g/8min离心，枪头吸去上清；
2、弹散管底沉淀，加入1ml的固定/破膜工作液，（1ml Fixation/Permeabilization Concentrate加入3ml Fixation/Permeabilization Diluent稀释），旋涡混匀,现配现用；
3、室温避光孵育30分钟， 600 g/10min离心，在吸水纸上倒扣流式管弃去上清（此时细胞已在管底形成很牢固的沉淀，不容易丢 失），弹散管底沉淀；
4、加入1ml Permeabilization Buffer(此为10X，须与蒸馏水1：10稀释成工作液)工作液离心洗涤细胞，破膜15分钟（室温避光）， 600 g/10min，在吸水纸上倒扣流式管弃去上清，弹散管底沉淀；
5、加入100μl Permeabilization Buffer（1x），同时加入相应的细胞因子染色抗体，室温避光孵育15分钟；
6、加1ml Permeabilization Buffer（1x），600 g/ 8min；在吸水纸上倒扣流式管弃去上清；弹散管底沉淀；
7、加入适量体积（建议300~500 ml）的PBS重悬细胞，并上机检测并分析。
Tips：1、根据实验需求选择相应的抗体，并做单染管用于调节补偿（具体如何设置单染管，可参照后文中补偿章节的介绍）。
2、尽量做同型对照，因细胞因子表达量不高（尤其是IL-4表达量非常低），细胞因子抗体对应的同型对照一般都要做。
3、PMA刺激会导致人T细胞表面CD4表达的下调，PMA与Lonomycin联合刺激下调非常明显，4h刺激后会下调50%以上，6h刺激几乎检测不到CD4，因此我们的界定CD4+T细胞是通过染CD3和CD8，来圈CD3+CD8-的细胞。
4、PMA对小鼠T细胞CD4表达影响很小，因此可以直接染CD4来圈门。
5、因破膜剂对细胞损伤较大，建议离心后形成的细胞沉淀先弹散形成细胞悬液，在加入破膜剂，这样会减少对细胞的损伤（形成的细胞碎片较少）。
人外周血TH1/TH17染色结果
注意：细胞破膜后对形态影响较小，因此可以直接圈淋巴门分析，在通过圈CD3+CD8-的细胞（此处未列出图）来分析CD4+的细胞表达细胞因子的量。因此此图横坐标就直接标的CD4。
人TH1/TH2/TH17染色所需抗体及辅助试剂
品牌 | 产品编号 | 产品名称 | 规格 | 价格 |
BioGems | 05111-60 | Anti-Human CD3 PE | 25 test/100 tests | 700元/ |
BioGems | 10111-50 | Anti-Human CD8a FITC | 25 test/100 tests | 560元/ |
BioGems | 80811-80 | Anti-Human IFN gamma APC | 25 test/100 tests | 1680元/ |
BioGems | 81111-77 | Anti-Human IL-4 PE-Cy7 | 25 test/100 tests | 1890元 |
BioGems | 73821-60 | Anti-Human IL-17A PE | 25 test/100 tests | 1890元 |
BioGems | 44212-80-100 | Mouse IgG1 Isotype Control APC | 100 mg | 1750元 |
BioGems | 44212-77-100 | Mouse IgG1 Isotype Control PE-Cy7 | 100 mg | 1890元 |
BioGems | 44212-60-100 | Mouse IgG1 Isotype Control PE | 100 mg | 1890元 |
BioGems | 2031560-5mg | Brefeldin A 布雷菲尔德菌素A | 5 mg | 880元 |
BioGems | 5608212-1mg | Ionomycin (calcium salt) 离子霉素 | 1 mg | 880元 |
BioGems | 1652981-1mg | Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA 佛波酯 | 1 mg | 880元 |
BioGems | 92110-00-150 | Permeabilization Buffer (10X) | 150 ml | 1030元 |
BioGems | 92160-00-160 | Transcription Factor Fixation/Permeabilization Diluent | 160 ml | 420元 |
BioGems | 92550-00-50 | Transcription Factor Fixation/Permeabilizatio Concentrate | 50 ml | 1050元 |
流式方案BioGems*资料。
背景知识
TH1/TH2/TH17细胞[3]
Th细胞是适应性免疫应答主要参与者。传统观念根据Th细胞分泌的细胞因子不同将其分为两型：一型能产生IFN-г的Th1细胞，在介导细胞免疫应答中起重要作用；另一型能产生IL-4的Th2细胞，它们与体液免疫应答有关。Th1／Th2细胞由共同前体细胞即CD4+T细胞分化而来，CD4+T细胞活化后，在IL-l2的作用下向Thl细胞分化。IL-l2是CD4+T细胞分化为Th1细胞的决定因子。IL-l2与IL-12R结合后诱导信号转导和STAT4分子的活化，可上调IFN-г，进而活化STAT1分子，并诱导Th1细胞分化特异性地转录因子T-bet。活化的CD4+T细胞在IL-4作用下向Th2细胞分化。
Th 17细胞是一型zui近发现的CD4+T细胞，主要分泌IL-17A(即IL-17)，与炎性反应和自身免疫疾病有关。活化的CD4+T细胞在IL- 21或IL-6与TGF-β的共同作用下，经STAT3通路激活视黄酸相关孤儿核受体(ROR)-гt和ROR-α，zui终分化为Th17细胞。
PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)是一种佛波酯，常用于激活某些类型的蛋白激酶C(PKC)，如group A (α, βI, βII, γ) 和group B (δ, ε, η, θ)异构体。佛波酯(包括PMA)的结构类似于二酰基甘油，可通过与PKC的C1域相互作用而活化PKC异构体。通过PCK，PMA也活化某些MAP激酶途径。PMA高浓度长时间作用于细胞可引起总PKC活性及其成瘤性的降低，而低浓度可能起保护作用。此外，PMA也促进造血分化。PMA的水溶性约是PDBu(phorbol-12,13-dibutyrate)的10倍，提示PMA更适合用于细胞学研究。
Ionomycin 离子霉素是Streptomyces conglobatus细菌生成的一种离子载体。用来提高胞内钙离子浓度，了解钙离子跨膜转运机制。也可用于刺激以下胞内因子产生：干扰素，穿孔素 ，IL-2和 IL-4，一般和佛波酯联合使用。这些细胞因子在炎症反应中有重要作用。
Brefeldin A布雷菲尔德菌素A通过间接阻止COP-I与高尔基膜的连接，抑制内质网到高尔基体的蛋白质转运。
引用
1 BioGems*资料
2 Wiki
3 《Th1、Th2、Th17和Treg研究现状》 张文林
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