BioLife Solutions CryoStor®是BioLife公司特别优化的细胞冻存液，在极低温度 (-70ºC to -196ºC)下准备和保存细胞。预混DMSO，为细胞和组织的冷冻、储存和解冻过程提供安全的保护环境。CryoStor®通过调控冻存过程的分子生物学反应，无血清、蛋白或具有高细胞毒性的试剂，就能增强细胞活力和功能。
BioLife Solutions CryoStor® Usage and Cryopreservation Protocol使用与冻存方法
CryoStor使用说明书
准备细胞
1. 待冷冻细胞配制悬液（机械法或酶法解离）。
2. 细胞悬液离心获得沉淀。
3. 去除上清液 - 注意：尽可能多地移除培养基，以降低CryoStor®冻存液被稀释程度。
细胞冻存
4. 分离：加入预冷的（2-8°C）CryoStor®冻存液。
a. 细胞密度：0.5-10×106 细胞/ mL，常规细胞培养方案（细胞密度可以更高）。
b. CryoStor®冻存液已经混合了DMSO，不需要再添加其他任何冻存剂。
5. 预冷：细胞/CryoStor®混合悬液2-8°C孵育约10分钟。
6. 成核：-70°C冷冻样品（许多方案交替使用-70°C和-80°C）
a. 大多数哺乳动物细胞，使用程序降温法 (-1°C/min)或类似方法。
b. 程序降温盒或异丙醇容器需要预冷到 2-8°C。
c. 约-5℃时 （-70°C冷冻约15-20min后）启动样品内的冰核形成（seeding），启动方法可以是程序降温仪控制的液氮喷放或是机械搅拌样本（轻弹或轻拍）。
d. 使用异丙醇容器的冷冻时间（-70°C）建议为3-4小时。
保存样本
7.样本保存
a. 长时保存温度液氮-130°C以下。
b. -80°C 保存建议只能用于短时期保存，几周到几月。
样本解冻
8. 解冻复苏：37°C水浴快速解冻样本。
a. 解冻时轻轻摇晃，直到看不到任何冰块。1mL冻存管样本解冻时间大约3分钟。
b. 样本不能在结冰点以上加热（0-10°C）。水浴中拿出来时，冻存管触感是冷的。不推荐被动解冻。
9. 立即用培养基稀释细胞/CryoStor®混合物。
a. 稀释步骤可以一步完成。
b. 稀释用培养基温度为20°C到 37°C。
c. 推荐稀释比例≥1:10 （样本：培养基）
10.合适的条件下培养细胞。
11. 使细胞进入培养环境或立即使用细胞。
12. 解冻后24h进行细胞活力检测。*
注意：细胞活力检测应该在解冻后24h进行，以保证结果准确，并且以非冷冻样本作为对照。
*解冻后立即使用细胞膜完整性指示剂进行样本检测，如台盼蓝，分析样本细胞产量和活力，结果一般会高于正常值。
推荐使用更准确的活力检测方法，活死细胞荧光分析或代谢分析（MTT or alamarBlue®）。
同时推荐视觉观察方法，细胞贴壁和“漂浮”情况。
CryoStor冻存液使用说明书翻译：红荣微再编辑，推荐配合英文原版使用。
Cryostor操作视频可咨询获得。
华雅再生医学旗舰公司：红荣微再（上海）生物工程技术有限公司 ：1500 1904 520。红荣微再-客服: 经销商专员
CryoStor冻存液英文原版说明书
细胞准备
1) 细胞重悬Place cells to be cryopreserved into suspension (mechanical or enzymatic dissociation)
2) 细胞离心Centrifuge cells to obtain cell pellet
3) 去上清液Remove supernatant - Note: Remove as much culture media as possible, to reduce dilution of CryoStor® solution.
加BioLife Solutions CryoStor CS10冻存液
4) ISOLATION: Add cold (2-8°C) CryoStor®
a. 细胞密度Cell concentrations: 0.5-10 x 106cells/ml for routine cell culture protocols (higher [cell] possible).
b. CryoStor CS10冻存液已经预混入DMSO。DMSO is pre-mixed in CryoStor® - no additives are necessary.
5) 冻存前冷孵育PRE-FREEZE: Incubate cell suspension at 2-8°C for approximay 10 minutes
6) NUCLEATION: Freeze samples at -70°C (many protocols utlilize -70°C and -80°C interchangeably)
a.程序降温 Use a controlled rate freeze (-1°C/min) or similar protocol for most mammalian cell systems.
b. The freezing device or isopropanol container should be pre-cooled to 2-8°C.
c. Ice nucleation within the sample (seeding) should be initiated at approximay -5°C using either a liquid nitrogen burst program setting on a controlled rate freezer or mechanical agitation (flick or tap) of the cryovial/sample container after approximay15-20 min. at -70°C.
d. Freeze time (-70°C) using isopropanol containers is recommended to be 3-4 hours.
BioLife Solutions CryoStor CS10储存
7) STORAGE: Place samples into storage
a. Store samples at liquid nitrogen temperatures (below -130°C).
b. Sample storage at -80°C is only recommended for short-term storage (weeks to months).
细胞复苏解冻
8) 水浴快速解冻THAWING: Thaw samples quickly in a 37°C water bath
a. Sample thawing should be conducted with gentle swirling of sample until all visible ice has melted. Approximate thaw time for a 1 ml sample in a cryovial is approximay 3 minutes.
b. DO NOT allow sample to warm above chilled temperatures (0-10°C). Cryovials should be cool to the touch when removed from bath.Passive thaw is not recommended.
9) 培养基稀释细胞Dilute cell/CryoStor® mixture immediay with culture media
a. Dilution procedure can be preformed in a single step.
b. The dilution media should be between 20°C and 37°C.
c. A dilution ratio of 1:10 (sample to media) or greater is recommended.
10) Plate cells in appropriate configuration
11) 细胞培养Place cells into culture conditions or utilize immediay
12) 复苏后细胞活力检测Viability assessment 24-hours post-thaw*
Note: To obtain an accurate measure of cell viability following cryopreservation, assessment should be performed 24 hours post-thaw and compared to non-frozen controls.
*Sample assessment immediay post-thaw with membrane integrity indicators, such as Trypan Blue, for comparative analysis of sample cell yield and viability often results in significant overestimates of cell survival.
Live/Dead fluorescent assays or metabolic assays (MTT or alamarBlue®) are recommended for more accurate viability assessment.
Visual inspection of adherent cells and cells “floating” in the media is also recommended.
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