A 产品组成—PicoPLEX WGA Kit 单细胞全基因组扩增试剂盒

试剂量可供50次反应。

B PicoPLEX WGA Kit储存与处理

-20℃储存。

使用前，细胞提取酶、预扩增酶和扩增酶组份放到冰上。其他组份使用前在冰上解冻并且稍微漩涡振荡（vortex and quick-spin）。

试剂储存、处理和反应设置都要遵守实验室PCR操作规范。

C单细胞全基因组扩增试剂盒其他准备材料

热循环仪（PCR仪，推荐使用实时PCR仪）

PCR管或96孔PCR板

低吸附吸头（Low-binding barrier tips）

磷酸盐缓冲液（PBS）

D PicoPLEX WGA Kit 单细胞全基因组扩增试剂盒产品描述

单管，3步，PicoPlEX WGA试剂盒专门用于人单细胞和pg级DNA的扩增，具有可重复性、低背景的特点。3小时内完成细胞裂解、热循环文库制备和低背景扩增，zui终能得到2-5µg扩增DNA。

PicoPLEX单细胞全基因组扩增流程

细胞+裂解/提取缓冲液，15min ——预扩增混合液，90min ——扩增混合液，30min ——分析

PicoPLEX WGA Kit适用样本

1.1-10个人细胞，如：囊胚细胞、极体、滋胚层细胞、羊水细胞、循环肿瘤细胞、培养细胞等。

2.1000-10000个细菌细胞

3.分离DNA（15pg-50pg人DNA）

4.分选染色体（Sorted Chromosomes ）

5.不完整或片段化，单/双链DNA

6.样本zui大体积：5µL

E PicoPLEX WGA全基因组扩增产物应用

拷贝数变异（CNV）分析，基于oligonucleotide aCGH, BAC aCGH, or qPCR

SNP 基因表型

突变检测

F PicoPLEX单细胞全基因组扩增细胞样本采集

细胞采集方法

兼容PicoPLEX WGA Kit的正确细胞采集方法有流式分选术，稀释和显微操作。细胞染色后可能会对试剂盒性能造成不好影响。为了得到*结果，一定要避免使用福尔马林固定法。

细胞洗涤

细胞样本制备时强烈推荐用PBS洗涤，以尽量减少非细胞DNA污染。选择不含镁、钙、BSA的PBS。zui终细胞样本中所含PBS体积不能超过2.5µL。

G 使用扩增后的对照DNA作为参照

DNA对照样本对于某些如微阵列和qPCR平台有参照价值。为了得到更准确的结果，强烈推荐PicoPLEX扩增样本的对照选择PicoPLEX扩增后的DNA对照而不是没有扩增的DNA对照。

DNA对照样本按样本配制方法（J）配制，按PicoPLEX操作步骤（K）扩增。Pooling DNA对照的扩增反应的产物可以得到*结果。

H PicoPLEX WGA全基因组扩增产物纯化和定量

WGA单细胞全基因组扩增产物用于下游时，许多应用使用前需要纯化和定量。纯化方法可以使用 spin columns或过滤板。

产物定量使用紫外吸光度法（UV absorbance ，1 OD260 = 50 µg/mL）。PicoGreen™或其他双链DNA定量法所得PicoPLEX产物密度可能不可靠。

纯化后的PicoPLEX扩增产物-20 °C储存。

I 选择合适的反应管/反应板

PicoPLEX操作指南的步骤7中，如果孵育时PCR管/板密封性不够，会造成大量（>5 µL）的试剂蒸发，zui终影响PicoPLEX WGA结果的稳定性和重复性。

步骤7也可以加15 µL 水，无视所选反应管/板密封性能否尽量减少蒸发造成的体积损失。（A mock PicoPLEX Protocol Step 6 incubation using 15 µL of water is advised to confirm whether a selected tube or plate/seal combination can be used with minimal volume loss due to evaporation.）

J样本配制方法

5µL细胞样本

1.依照F所述方法用PBS稀释或淋洗细胞。

2.如果采用流式分选采集细胞：

单个细胞加入含5 µL细胞提取缓冲液（绿盖）的PCR管/孔。

如果采用显微操作或稀释法：

单个细胞先用zui少PBS（<2.5 µL)）混合，再加入含适量细胞提取缓冲液（绿盖）的PCR管/孔，zui终样本体积5 µL。

1. 配制好的细胞立即 -80 °C 冻存或直接进行扩增操作。

5µL DNA样品（单细胞simulation）

1.配制1 ng/µL 纯化DNA溶液：PCR管/孔中，5 mM Tris-HCl (pH8.0)稀释对照DNA。

2.漩涡振荡30s。

3.配制15 pg/µL DNA溶液：3µL 1 ng/µL DNA溶液+197 µL 5 mM Tris-HCl (pH 8.0)。

4.漩涡振荡30s。

5.PCR管/孔中，1 µL 15 pg/µL DNA溶液+ 4 µL 细胞提取缓冲液（绿盖）。

K PicoPLEX操作步骤

细胞提取

1.添加提取混合液各组份并充分混匀。

2.每5µL细胞样本或DNA样本（J部分配制）加5 µL新鲜配制的提取混合液。

3.按下表在热循环仪中孵育样本：

4.试管/板稍微离心。

预扩增

5.添加预扩增混合液各组份并充分混匀。

6.每个细胞样本/DNA样本加5µL预扩增混合液。

7.按下表在热循环仪中孵育样本：

8.稍微离心，预扩增孵育产物放到冰上。

扩增

9.添加扩增混合液各组份并充分混匀。

注意：样本扩增效率可以通过在扩增混合液中添加SYBR Green I dye（zui终密度：0.125x）进行实时PCR仪分析。一些仪器需要额外添加其他染色剂做信号归一化（signal normalization）。

10. 新鲜配制的扩增混合液取60 µL和15 µL预扩增孵育产物混合，吸管混匀。

11.按下表在热循环仪中扩增样本：

注意：基于Rubicon用流式分选培养细胞的测试，推荐14 cycles。一些细胞类型要获得zui高产量，可能需要更多cycles（zui高达16 cycles）。

12.PicoPLEX 扩增产物立即 -20 °C储存或用于下游纯化（见H）。

RB3050 Rubicon PicoPLEX WGA Kit 单细胞全基因组扩增试剂盒说明书由华雅再生医学旗舰公司：红荣微再翻译。

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RB3050 Rubicon PicoPLEX WGA Kit 单细胞全基因组扩增试剂盒

从单细胞中扩增DNA构建高重复性的文库现在成为可能。PicoPLEX WGA kit采用技术，设计、优化用于从单细胞中扩增单拷贝基因组DNA。起始量低至单细胞或6pg基因组DNA。便捷的单管操作流程减少失误，节省时间并降低反应背景。

PicoPLEX WGA Kit兼容微阵列比较基因组杂交（array CGH）分析及PCR平台，被试管婴儿行业供应商如BlueGnome信赖并用于PGS/PGD。

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