试剂盒组份
组份 | 规格 |
REPLI-g sc DNA Polymerase (blue lid) DNA聚合酶（蓝盖） | 48 µl |
REPLI-g sc Reaction Buffer (yellow lid) 反应缓冲液（黄盖） | 700 µl |
Buffer DLB (clear lid) DLB缓冲液（透明盖） | 1 tube |
Stop Solution (red lid) 终止液（红盖） | 1.8 ml |
PBS sc 1x (clear lid) PBS 1x（透明盖） | 1.5 ml |
DTT, 1 M (lilac lid) DTT，1M（紫盖） | 1 ml |
H2O sc 水 | 1.5 ml |
Quick Start Protocol | 1 |
操作方法选择
根据起始样本选择操作方法
起始样本 | 方法 |
单细胞，2-1000个细胞 | 方法一：从单细胞扩增基因组DNA |
纯化基因组DNA（1-10ng） | 方法二：纯化基因组DNA扩增 |
其他起始样本：血浆血清、活检、需要高通量扩增的样本等参见其他对应说明书。
操作流程
方法*程
细胞样本——加入变性混合液——65°C孵育10min——加入终止液——加入Master混合液——30°C孵育8h，65°C 终止3min——获得扩增DNA
方法二流程
纯化基因组DNA——加入变性混合液——15-25°C孵育3min——加入neutralization混合液——加入Master混合液——30°C孵育8h，65°C 终止3min——获得扩增DNA
需要自备的仪器和试剂
微离心管
水浴或其他加热仪器
微型离心机
漩涡混合仪（Vortexer）
吸管和吸头
冰
方法一：从单细胞扩增基因组DNA
实验开始前注意事项
1.适用样本：1-1000个完整细胞
这个方法适用于所有物种的单细胞样本，如：脊椎动物，细菌（革兰氏阳性菌和阴性菌），植物（细胞壁已脱），分选细胞，组织培养细胞和细胞。
不适用样本：福尔马林固定样本或其他使用交联剂固定的样本，如：从福尔马林固定石蜡包埋组织中激光显微切割得到的单细胞样本。
2.小心试剂不要被外源DNA污染。如：使用干净独立吸头吸管，在无DNA地方进行反应操作。
3.纯化基因组DNA扩增参见方法二。
4.聚合酶要在冰上解冻（见步骤6）。其他成分可以室温解冻（15–25°C）。
5.配制的D2缓冲液（变性缓冲液）存放不要超过3个月。
6.阴性对照（无模板）的DNA产量约 40 µg。因为REPLI-g 的单细胞扩增反应中，引物二聚体的随机扩增得到高分子量的DNA产物。这一DNA不会影响实际样本质量，也不会影响下游分析造成阳性结果。
开始前准备
1.DLB缓冲液加500µl试剂盒的水混匀，稍微离心溶解。
注意：重组的DLB缓冲液–20°C能放6个月。
Buffer DLB is pH-labile.
2.所有缓冲液和试剂使用前都要用漩涡混合器充分混匀。
3.水浴，heating block或热循环仪温度设为30°C。
如果热循环仪带加热盖，盖子温度设为70°C。
步骤¢
1.按表1配制足量（整个扩增流程所需）D2缓冲液（变性缓冲液）。
注意：表中提供的D2缓冲液用量足够进行12次反应。没用完的D2缓冲液–20°C 存放，但不要存放超过3个月。
表1.D2缓冲液配制
成分 | 体积 |
DTT, 1 M | 3 µl |
Buffer DLB (reconstituted) DLB缓冲液（重组，见“开始前准备”） | 33 µl |
总体积 | 36 µl |
2. 4 µl样本细胞（含PBS）加入微离心管。如果细胞不够4 µl，加PBS sc补齐。
注意：REPLI-g单细胞扩增试剂盒提供的PBS sc量不够用于样本细胞的连续稀释。
可以使用0.5 µl 全血。（Alternatively, 0.5 µl whole blood can be used.）
3.加入3 µl 配制的D2缓冲液。小心轻弹试管混匀，稍微离心。
注意：确保样本细胞没有贴在缓冲液线上的管壁。
4.65°C孵育10min。
- 加入3 µl 终止液。小心轻弹试管混匀，稍微离心。冰上保存。
6.冰上解冻REPLI-g sc DNA聚合酶。其他成分室温解冻，漩涡振荡后稍微离心。
解冻后REPLI-g sc反应缓冲液可能会形成沉淀，漩涡振荡10s可以溶解沉淀。
7.按表2配制master混合液。混匀，稍微离心。
要点：严格按照表2所列顺序配制。加入水和反应缓冲液后，稍微漩涡振荡和离心后再加入DNA聚合酶。
注意：一次性进行多次反应时，根据反应数量等比例增加用量。DNA聚合酶加好后maste混合液要立即投入使用。
表2：master混合液配制
成分 | 体积/反应 |
H2O sc | 9 µl |
REPLI-g sc Reaction Buffer 反应缓冲液 | 29 µl |
REPLI-g sc DNA Polymerase DNA聚合酶 | 2 µl |
总体积 | 40 µl |
多次反应，根据反应数量等比例增加剂量并增加10%。
8.每次反应，10 µl 变性DNA（步骤5）加入40 µl master 混合液。
9.30°C孵育8h。
30°C孵育后，水浴或其他加热仪可以改设为65°C方便步骤10使用。
注意：如果使用带加热盖的热循环仪，盖子温度设为70°C。
10.DNA聚合酶65°C灭活3min。
11.如果不直接使用，扩增DNA 短期储存在4°C，长期储存在–20°C。
使用REPLI-g 单细胞扩增试剂盒扩增的DNA可以当作基因组DNA（zui低冻融循环），因此推荐zui低核酸储存密度为100 ng/µl。
12.依照说明书用水或TE适量稀释扩增DNA。用于PCR分析的扩增DNA按1:100稀释，每次PCR反应使用2 µl 稀释后DNA。
13.扩增DNA可用于一系列下游应用，包括：第二代测序，array CGH和定量PCR。
注意：每50 µl典型反应的DNA产量约40 µg，需要正确稀释。扩增DNA定量见附件A。
方法二：纯化基因组DNA扩增
略。详情参见原版说明书。中文版翻译可咨询红荣微再。
150343 REPLI-g Single Cell Kit单细胞扩增试剂盒说明书节选由红荣微再翻译整理。
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产品订购信息
品牌 | 货号 | 产品描述 |
QiaGen | 150343 | REPLI-g Single Cell Kit单细胞扩增试剂盒 |
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