【复苏】

　　1.将配置好的*培养基放入37℃水浴中预热5-15 min;

　　2.从液氮中取出干细胞迅速放入37℃水浴快速解冻(解冻后不要继续孵育细胞);

　　3.在超净台中加入5 ml的 *培养基重悬细胞，1000 rpm离心5 min;

　　4.弃上清，加入 5 ml的*培养基重悬细胞，转移到T-25培养瓶中(带滤芯);

　　5.将培养瓶置于37℃，5%CO2 的无菌恒温培养箱中培养;

　　6.第二天用新鲜的 *培养基给细胞换液。

　　间充质干细胞无血清培养基【 培养】

　　1.在显微镜下观察细胞，当细胞融合度达到80%时，即可传代;

　　2.37℃水浴预热*培养基;

　　3.在超净台中，弃掉T-25细胞培养瓶中的培养基，加入2 ml PBS清洗，再加入1 ml 0.25%胰酶-EDTA消化细胞;

　　4.在显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，即可加入5 ml *培养基终止消化;

　　5.用移液器轻轻吹打瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散;

　　6.将细胞转移到15 ml离心管中，1000 rpm离心5 min;

　　7.弃上清,加入15-20 ml的 *培养基重悬细胞后转入T-75细胞培养瓶中或按适当比例传到T-25细胞培养瓶中。确保后融合度在25-50%之间，细胞密度在1×104cells/cm2 (2.5×105 cells/T-25瓶)，混合细胞悬液，确保细胞均匀分布;

　　8.将细胞培养瓶置于37℃，5%CO2 的无菌恒温培养箱中培养;

　　9.每两天用新鲜、预热的*培养基进行换液。

　　间充质干细胞无血清培养基【冻存】

　　1.细胞消化和计数，用胰酶对待冻存的细胞进行消化，并对细胞进行计数。

　　2.1000 rpm离心5 min，去掉上清。

　　3.根据细胞计数的情况，加入适量的冻存液，使细胞密度在1×106/ml左右(或根据自己希望达到的细胞密度)。

　　4.轻轻地重悬细胞(务必重悬均匀)，将重悬的细胞按等份加入到灭菌的冻存管(需提前做好标记或者贴上标签)中，旋紧冻存管盖。

　　5.将冻存管放入程序降温冻存盒中，然后将冻存盒直接放入-80℃。

　　6.第二天将细胞从-80℃转移到液氮中。